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日期:2021-07-29瀏覽:6377次
基本原理:
外源目的DNA與載體分子的連接稱(chēng)為DNA重組,重組的DNA稱(chēng)為重組體或重組子。研究中需要克隆或表達的基因為外源DNA,載體是指能夠攜帶外源基因進(jìn)入受體細胞,并在其中進(jìn)行擴增或誘導外源基因表達的工具,其中質(zhì)粒載體最為常用。
質(zhì)粒是獨立于細菌染色體外具有自我復制的DNA分子。所有的質(zhì)粒都有復制子、選擇性標志和多克隆位點(diǎn)3個(gè)共同的特性。質(zhì)粒載體的選擇包括載體的大小、載體拷貝數、多接頭以及篩選插入片段的能力,pcDNA3.1(+/-)是比較常用的真核表達載體。
基本步驟:
1、目的DNA片段的獲得。這一步驟中,可以選擇通過(guò)設計引物進(jìn)行PCR擴增來(lái)獲得目的DNA片段,也可以通過(guò)化學(xué)合成的方法來(lái)獲得目的DNA片段,這里值得注意的點(diǎn),目的DNA片段5'和3'端需要引物合適的酶切位點(diǎn),方便后續與質(zhì)粒載體的連接。
2、目的DNA片段與質(zhì)粒連接。通過(guò)選擇的酶切位點(diǎn)將環(huán)形的質(zhì)粒酶切成線(xiàn)性,與目的DNA片段進(jìn)行連接反應,而后轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中,進(jìn)行培養。
3、連接產(chǎn)物轉化及鑒定。挑選2-3個(gè)單克隆置于含有抗性的液體培養基中進(jìn)行擴大培養。提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,雙酶切后電泳,能夠看到存在與目的DNA片段大小一致的條帶,說(shuō)明此單克隆插入了目的DNA片段,而至于目的DNA片段中堿基序列是否存在突變點(diǎn),需進(jìn)行一代測序驗證。只有同時(shí)滿(mǎn)足雙酶切鑒定大小合適并且測序后DNA堿基序列*一致的單克隆菌才被認定為構建成功的重組子。
4、鑒定正確的重組質(zhì)粒擴大培養及保種。將上述構建成功的重組子質(zhì)粒菌種再一次擴大培養,提取重組子質(zhì)粒以及進(jìn)行保種,方便后續實(shí)驗使用。
值此,包含此外源DNA的重組DNA的構建算全部完成。
注意事項及心得體會(huì ):
1、目的DNA片段獲取過(guò)程中,如果選擇通過(guò)設計引物進(jìn)行PCR擴增方法來(lái)獲得,建議選擇高保真的酶來(lái)進(jìn)行擴增反應,這樣在一定程度上可以降低因為擴增反應而產(chǎn)生的堿基引入錯誤。
2、PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物盡量不要放置時(shí)間過(guò)長(cháng),最好是即時(shí)進(jìn)行連接。
3、連接體系中載體與目的基因的分子數比例,需要摸索合適的比例,一般為1:3--1:10,合適的比例能夠提高連接效率。