41、跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮"是什么原因呢？是有的成分不對嗎？

答：沒(méi)什么問(wèn)題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過(guò)夜時(shí)拿保鮮膜包起來(lái)，在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問(wèn)題，你可以重新配制一份觀(guān)察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。

42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

答：這么廣的分布不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12％SDS-PAGE， 濕轉120mA， 45-60min就可以了， 可以根據你實(shí)驗室的經(jīng)驗調節；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。

43、不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上， 轉移效率低怎么樣解決？

答：可以考慮：轉移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和PVDF膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長(cháng)轉移時(shí)間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉移膜，或使用小孔徑的PVDF膜（0.2微米）。

44、我用的是可視marker，但是電泳總跑不全8條帶，請問(wèn)什么原因？怎樣改善？膠用過(guò)8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買(mǎi)的。

答：一般來(lái)說(shuō)，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。

45、是否Western Blot實(shí)驗半定量一定要加ACTIN內參？

答：半定量實(shí)驗需要有內參。

46、核內抗原Western Blot內參選擇什么合適？

答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩定的，有很多都可以當成內參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內參。

47、做半定量Western Blot，內參β-actin，GAPDH哪個(gè)好？

答：兩者均可。

48、想問(wèn)一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來(lái)源的影響？胞膜和胞漿有區別嗎？

答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來(lái)說(shuō)都沒(méi)有區別。

49、轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉"，其中TBST最后那個(gè)T是Tween嗎，濃度多大？

答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調節pH 至 7.4, 加水定容至 1L。

50、封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒(méi)有什么規定呢，比如在室溫里做，或者要在4度下?

答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，然后4度過(guò)夜。

51、請問(wèn)一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話(huà)，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結果較差。PVDF膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合，同時(shí)也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話(huà)，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。

52、怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道都能很直，上樣的量和灌膠是否很重要，電壓有什么要求？

答：影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個(gè)因素：

（1）電壓，小的電壓會(huì )使膠的分子篩效應得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠55v，分離膠75v就能跑得很好。

（2）膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時(shí)，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠.

53、為什么提高大分子量蛋白的轉移的時(shí)候，小分子量蛋白會(huì )丟失一些哪?什么原因?

答：小分子的蛋白在轉移過(guò)程中，會(huì )透過(guò)膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過(guò)去了。

54．電泳中常出現的一些現象：

●︶ 條帶呈笑臉狀

原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統溫度偏高。

●︵ 條帶呈皺眉狀

原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不*。

●拖尾

原因：樣品溶解不好。

●紋理（縱向條紋）

原因：樣品中含有不溶性顆粒。

●條帶偏斜

原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

●條帶兩邊擴散

原因：加樣量過(guò)多。

55．Western blot結果中背景較高

可能的原因及建議：

●膜封閉不夠

延長(cháng)封閉的時(shí)間；選擇更加適合的封閉液。

●一抗稀釋度不適宜

對抗體進(jìn)行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。

●一抗孵育的溫度偏高

建議4℃結合過(guò)夜。

●選擇的膜容易產(chǎn)生高背景

一般硝酸纖維素膜的背景會(huì )比PVDF膜低。

●膜在實(shí)驗過(guò)程中干過(guò)

實(shí)驗過(guò)程中要注意保持膜的濕潤。

●檢測時(shí)曝光時(shí)間過(guò)長(cháng)

減少曝光時(shí)間。

56．Western blot結果中雜帶較多

可能的原因及建議：

●目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙?；稽c(diǎn)等），本身可以呈現多條帶。

查閱文獻或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過(guò)去修飾確定蛋白實(shí)際大小。

●目的蛋白有其它剪切本

查閱文獻或生物信息學(xué)分析可能性。

●樣本處理過(guò)程中目的蛋白發(fā)生降解

加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作。

●上樣量過(guò)高，太敏感

適當減少上樣量。

●一抗特異性不高

重新選擇或制備高特異性的抗體。

●一抗不純

純化抗體

●一抗或者二抗濃度偏高

降低抗體濃度。

57 . Western blot結果中無(wú)信號或顯示信號弱

可能的原因及建議：

●檢測樣本不表達目的蛋白

選擇表達量高的細胞作為陽(yáng)性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。

●檢測樣本低表達目的蛋白

提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。

●轉移不*或過(guò)轉移

可以用麗春紅染膜并結合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉至膜上或轉移過(guò)頭；適當調整轉膜的時(shí)間和電流。

●抗體不能識別測試種屬的相關(guān)蛋白

購買(mǎi)抗體前應當認真閱讀抗體說(shuō)明書(shū)，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白。

●一抗孵育時(shí)間不足

建議4℃結合過(guò)夜。

●二抗與一抗不匹配

選擇針對一抗來(lái)源的種屬的抗體。

●洗膜過(guò)度

洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，加入的去垢劑不宜過(guò)強或過(guò)多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

58. 其它現象：

●膜上多處出現黑點(diǎn)或黑斑

原因：抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結合。

●反白（條帶顯白色）

原因：目的蛋白含量太高或者一抗濃度偏高。

●蛋白分子量偏低或偏高

原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。

59．安全問(wèn)題：

操作有毒試劑時(shí)，帶手套，且操作揮發(fā)性試劑應在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。