Western blot實(shí)驗過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題匯總及處理方案。

21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？濃縮膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？

答：分離膠用7％，濃縮膠 3.5％，200kd的蛋白不好做。

22、如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？

答：可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì )有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。

23、蛋白變性后可以存放多久？

答：－80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。

24、我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說(shuō)分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？

答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線(xiàn)性分辨范圍內，但需注意條帶位置。

25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì )影響親和素生物素的生成，是嗎？

答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點(diǎn)．

26、問(wèn)一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關(guān)系嗎？

答：Western Blot一般上樣30－100ug不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(cháng)短有關(guān)。開(kāi)始摸條件時(shí)，為了拿到陽(yáng)性結果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(cháng)一點(diǎn)，當然背景也就出來(lái)了。要拿到好的結果，如果抗體好的話(huà)比較容易，抗體不好的話(huà)就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。

27、做組織樣品的western的時(shí)候，怎樣處理樣品？

答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì )更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。

28、問(wèn)大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

答：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠最好選擇7%的；剝膠時(shí)要小心；轉移時(shí)間需要相應延長(cháng)；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）。

29、有什么方法可以提高上樣量？

答：a)可以濃縮樣品；增大上樣體積來(lái)增大上樣量；b)用5倍的上樣緩沖液來(lái)稀釋變性

30、蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求？

答：上樣量要根據實(shí)驗的要求來(lái)定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超載。

31、一抗，二抗的比例是否重要？

答：比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。

32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

答：對二抗無(wú)要求，要看你實(shí)驗條件來(lái)選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。

33、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

答：免疫組化時(shí)抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱(chēng)表位），有些表位是線(xiàn)性的，而有的屬于構象型；線(xiàn)性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會(huì )消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個(gè)氨基酸，也就是線(xiàn)性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。

34、Western Blot 中抗體的可以重復應用嗎？

答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4度保存，避免反復凍融。

35、在做Western Blot時(shí)，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結合，做小分子的蛋白轉移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。

36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？

答：可以。

37、轉膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉膜好象不是很好，為什么？

答：這是正常的，大分子的蛋白轉移的慢， 你延長(cháng)轉移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì )好的多，但是小分子的就有可能會(huì )變淡。

38、做Western Blot時(shí)，同樣的抗體免疫組化能做出，而Western Blot卻不能？

答：這多半是抗體的問(wèn)題，要看抗體的說(shuō)明，是否能做Western Blot和免疫組化。

39、如果是6×8轉印膜，要加多少一抗？

答：一抗的稀釋度是有說(shuō)明的，根據你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為3－5ml。

40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果。

答：無(wú)特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復使用過(guò)一兩次的緩沖液。