德國科隆大學(xué)的研究人員提出了一種對mRNA進(jìn)行雙重化學(xué)修飾的策略，并評估了這些修飾對mRNA功能的影響。

從感染性疾病到癌癥再到各種罕見(jiàn)疾病，mRNA在各種疾病中都顯示出潛在的治療價(jià)值。

然而，mRNA分子不穩定，易降解，通常需要對mRNA天然堿基進(jìn)行修飾，如capping, tail, modification和replace。

例如，兩種正式推出的病毒mRNA疫苗的mRNA分子都進(jìn)行了不同程度的特殊修飾。

這些特殊修改的效果如何?這也是科學(xué)家需要深入研究和解決的問(wèn)題。準確定量的鑒定mRNA的修飾位點(diǎn)和修飾方法是深入分析mRNA修飾功能和機制的前提，也為提高mRNA的穩定性和效率提供了新的方向。

德國科隆大學(xué)的研究人員提出了一種對mRNA進(jìn)行雙重化學(xué)修飾的策略，并評估了這些修飾對mRNA功能的影響。

在這項研究中，該團隊在mRNA轉錄過(guò)程中引入了第三個(gè)堿基對，將非自然的核苷酸引入到特定的位點(diǎn)，同時(shí)結合自然的mRNA修飾方法。

研究發(fā)現，雙化學(xué)修飾的mRNA可以形成協(xié)同效應，提高mRNA的穩定性、效率和蛋白表達。

本團隊利用該方法對mRNA進(jìn)行標記，并進(jìn)一步研究了人工修飾核苷酸對mRNA效率和穩定性的影響。

“我們研究了這種化學(xué)修飾的mRNA在細胞中的穩定性，合成的mRNA是否可以用作細胞中高效蛋白質(zhì)生產(chǎn)的模板，以及化學(xué)修飾對翻譯成蛋白質(zhì)的影響"，肖爾教授說(shuō):“研究結果表明，這種新方法在監測mRNA進(jìn)入細胞、監測和影響其在細胞水平的傳播以及信息轉錄的效率方面非常有效。"

該研究成果已被《Chemical Science》雜志接受。

這項研究是由科隆大學(xué)有機化學(xué)研究所的斯蒂芬妮·卡特-肖爾教授領(lǐng)導的，她從2020年開(kāi)始在科隆大學(xué)化學(xué)系擔任教授。

實(shí)驗室主要研究方向為核酸化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)，包括功能RNA-核酸化學(xué)修飾、催化RNA和非編碼RNA功能研究。

根據研究小組的說(shuō)法，這種方法有望為開(kāi)發(fā)更有效的mRNA療法開(kāi)辟新的可能性。

雙化學(xué)改性，達到協(xié)同增效

目前，有多種修飾技術(shù)可用于產(chǎn)生更穩定的mRNA，大致可分為三類(lèi)：用人工合成的非天然核糖核酸代替天然核糖核酸合成mRNA；添加5′caps、3′poly（A）“尾"和UTR（未翻譯區）序列；并采用特殊的新型配方技術(shù)，有效保護mRNA。

其中，人工合成非天然核糖核酸取代天然核糖核酸合成mRNA是較為常用的方法之一。真核mRNA上的化學(xué)修飾大致可以分為三類(lèi):甲基化、偽尿苷(Ψ)和次嘌呤。

經(jīng)過(guò)研究和工業(yè)應用，該方法可以降低mRNA固有的免疫原性和不穩定性。例如，Moderna和BioNTech的mRNA疫苗都使用偽尿嘧啶修飾來(lái)維持mRNA的穩定性。

隨著(zhù)mRNA治療的不斷發(fā)展，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界一直在尋找更多的改進(jìn)方法，以提高mRNA的效率和穩定性。深入分析這些修飾對mRNA的功能影響，是控制mRNA結構、提高其穩定性和翻譯活性的重要基礎。

為了進(jìn)一步研究這些化學(xué)修飾對mRNA的影響，Stephanie kat - schorr的團隊提出了結合位點(diǎn)特異性插入合成核苷酸和自然堿基修飾的想法。

在他們的實(shí)驗中，通過(guò)在DNA到RNA的酶轉錄過(guò)程中引入第三個(gè)堿基對，他們在3 ' -UTR處插入了合成的核苷酸，包含了Ψ和5mC(甲基化修飾)。，并設計了一系列實(shí)驗來(lái)觀(guān)察、量化和驗證mRNA的功能。

重要的是要注意,引入合成核苷酸通過(guò)基因轉錄(GENAEXT)字母擴張建立在以前的工作由各自的團隊一郎Hirao弗洛伊德Romesberg,他在2018年發(fā)表的研究指出,不自然的堿基對可以轉錄精度高、效率高。

在此基礎上，通過(guò)將功能化的非自然核苷酸具體引入長(cháng)mRNA片段進(jìn)行了改進(jìn)。

在這項研究中，科隆大學(xué)團隊在體外合成了功能化和編碼蛋白質(zhì)的GENAEXT mRNA，其中包括CP修飾，可以編碼紅色熒光報告蛋白mCherry。

具體包括在3 ' -UTR區域插入環(huán)丙烯(CP)， mRNA上Ψ和5mC修飾以提高其活性，以及引入5 ' cap和3 ' tail修飾。

然后，將修飾后的mRNA通過(guò)脂質(zhì)體轉染到哺乳動(dòng)物細胞中，通過(guò)逆轉錄定量PCR (RT-qPCR)分析mRNA水平和mCherry報告基因的表達，并與cp修飾的GENAEXT mRNA與未修飾的mRNA的翻譯效率進(jìn)行比較。

數據表明，經(jīng)過(guò)雙重化學(xué)修飾方法(自然堿基修飾和CP非自然堿基對插入)的mRNA在細胞內翻譯可以產(chǎn)生協(xié)同效應，這種合成的mRNA可以增加蛋白表達，提高轉染效率、有效性。

此外，cp修飾的mRNA在活細胞中通過(guò)反電子需求Diels-Alder (iEDDA)反應進(jìn)行熒光標記。

用四嗪熒光團衍生物對合成的mRNA進(jìn)行iEDDA處理后，研究人員可以通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察活細胞中的mRNA，同時(shí)也可以在時(shí)間和空間上跟蹤mRNA。

iEDDA:一種無(wú)催化劑的點(diǎn)擊反應(環(huán)加成反應)，具有生物相容性好、反應特異性高、反應速度快、毒性低等優(yōu)點(diǎn)。

為了評估mRNA轉染過(guò)程中的細胞狀態(tài)和活細胞中的click反應，他們還進(jìn)行了細胞活力測定。

釋放更多的mRNA潛能?

事實(shí)上，從mRNA序列進(jìn)入細胞到引導細胞分泌蛋白質(zhì)的過(guò)程存在許多困難，包括在進(jìn)入細胞之前被無(wú)處不在的RNAse水解成小核苷酸分子;穩定表達,等等。

如前所述，利用人工合成的非天然核苷酸取代天然核苷酸合成mRNA已經(jīng)是常用的mRNA修飾方法之一。

同時(shí)，通過(guò)在特定的mRNA片段中引入人工合成的非天然核苷酸，證明了修飾mRNA的可行性。在本研究中，該團隊將這兩種方法結合起來(lái)，提高了蛋白質(zhì)合成效率和轉染效率。

因此，研究團隊認為，他們的實(shí)驗結果表明，GENAEXT方法的使用將為mRNA修飾的研究提供新的思路。

“這種方法可能為mRNA修飾開(kāi)辟新的可能性微調mRNA的特性，并通過(guò)共價(jià)載體系統將mRNA高效傳遞到細胞中，"該團隊指出，他們已經(jīng)通過(guò)一系列的研究表明，原則上，GENAEXT方法可以應用于任何長(cháng)度的mRNA序列，而與四嗪衍生物的iEDDA click反應將使mRNA更功能化。

此外，該團隊認為，通過(guò)在mRNA的非翻譯區引入人工調節元件，調控mRNA翻譯水平的潛力可能被解鎖。

同時(shí)，他們提到，該方法除了能夠在細胞實(shí)驗中附著(zhù)各種報告基團外，還具有應用于體外蛋白質(zhì)結合實(shí)驗以鑒定mRNA結合蛋白的潛力。

此外，該團隊提出的方法還將為檢測修飾后mRNA的穩定性和表達效率提供一個(gè)新的“把柄"。目前，科學(xué)家們已經(jīng)在定量和高通量?jì)蓚€(gè)方向開(kāi)發(fā)了多種方法。

更常用的方法包括通過(guò)結合特異性抗體的高通量富集，化學(xué)小分子/化學(xué)小分子衍生物的富集，以及特殊性質(zhì)。測序技術(shù)。

對于下一個(gè)計劃，研究小組表示，他們正在開(kāi)發(fā)更有效地包裝mRNA的方法，以更好地保護mRNA，使其順利進(jìn)入細胞。