養細胞這件事兒，看似簡(jiǎn)單，然而卻常常因為各種原因，讓我們珍貴的實(shí)驗細胞一再受損或者死亡，今天為大家講述細胞從復蘇、傳代到凍存等一系列過(guò)程及常遇到的那些你可能忽略的小卻重要的細節。

一、細胞的營(yíng)養來(lái)源

針對大多數腫瘤細胞，營(yíng)養配方一般為：90%合成培養基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS)；為了防止污染，可以加1%雙抗！

不同細胞的培養基是不同的。一般ATCC購買(mǎi)的細胞，針對不同細胞株，會(huì )有詳細介紹，包括生長(cháng)的狀態(tài)圖、培養基的類(lèi)型等。培養基一般都是偏紅色，因為培養基加了酚紅來(lái)顯示顏色，指示pH范圍為6-8，顏色會(huì )由黃變?yōu)樽霞t。這是為了我們能更直觀(guān)觀(guān)察培養液的變化，如變黃，則代表偏酸，偏堿性了就顯示偏紫色。一般來(lái)說(shuō)，細胞吸收營(yíng)養后，變黃后就暗示我們要換培養基啦！若是細胞生長(cháng)緩慢或者實(shí)驗設計需求，是可以增加血清比例的，一般10%-20%的血清比例是比較OK的，也不建議太高的血清比例。

二、細胞的居住環(huán)境

舒適無(wú)菌的環(huán)境是細胞健康生活的重要基礎。細胞居住在培養細胞的器皿，包括形狀、規格、用途多樣的培養瓶、培養皿及培養板中。最終住進(jìn)37℃，5%CO₂的恒溫培養箱。

根據不同實(shí)驗的目的和用途，可以選擇不同規格的培養板或培養皿，如后期要進(jìn)行流式細胞檢測，一般使用 6 孔的細胞培養板來(lái)培養細胞，如果濕要進(jìn)行爬片處理，建議使用 24 孔的細胞培養板，進(jìn)行MTT實(shí)驗來(lái)檢測細胞活力的話(huà)，一般用 96 孔板來(lái)種植細胞等，如果后期實(shí)驗需求細胞量大，可以使用大的培養瓶，甚至細胞培養工廠(chǎng)來(lái)進(jìn)行。就細胞培養狀態(tài)來(lái)說(shuō)，培養瓶和培養皿沒(méi)有太大區別，主要在于安全系數(培養瓶>培養皿)、培養細胞數量(大培養瓶>培養皿)。但是培養瓶成本也會(huì )相對較高，因此無(wú)特殊要求，一般選擇培養皿即可。

三、細胞的復蘇與凍存(原則是慢凍速融)

1. 細胞復蘇：指將凍存的細胞解凍之后重新培養，細胞恢復生長(cháng)的過(guò)程。

復蘇過(guò)程如下圖所示：

有時(shí)候會(huì )出現細胞復蘇后，難以貼壁的情況，這個(gè)時(shí)候主要考慮細胞凍存時(shí)狀態(tài)差或者復蘇時(shí)動(dòng)作太慢導致細胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時(shí)搖動(dòng)冷凍管，使之盡快通過(guò)最易受損的溫度段(-5～0℃)。還有一種情況就是細胞貼壁了，卻長(cháng)不起來(lái)，這是因為一些細胞傾向于維持一定的密度，可將細胞轉移到較小的培養瓶或皿中進(jìn)行培養。

2. 細胞凍存 將細胞放在低溫環(huán)境(-70℃~-196℃)，細胞內的代謝降低，可最大限度的保存細胞活力，以便長(cháng)期儲存。

目前細胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護劑，細胞凍存液的配方有很多種，如培養基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，復蘇存活率在80%～90%以上。大部分實(shí)驗室用細胞凍存盒來(lái)進(jìn)行細胞凍存，如果沒(méi)有細胞凍存盒，可先將凍存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或過(guò)夜，最后放入液氮罐內。為了節約時(shí)間，還可直接在凍存盒外包裹一團棉花，用棉花代替凍存盒緩慢降溫的特點(diǎn)，將細胞轉移至-80℃冰箱過(guò)夜，再轉移至液氮保存。為了保證細胞復蘇后的細胞數量，一般在凍存細胞時(shí)每管細胞的濃度應在10⁶—10⁷個(gè)/ml/管。

四、細胞的傳代培養

細胞傳代：細胞在培養過(guò)程中不斷增殖，培養皿/瓶空間有限，當細胞接觸過(guò)密，生長(cháng)就會(huì )受到抑制，影響細胞狀態(tài)，因此我們要把其中一部分細胞分到別的培養皿/瓶里。

Q：為什么我們總說(shuō)選擇對數期細胞傳代?

A：細胞的生長(cháng)和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對數期(指數期)，平穩期(平臺期)和衰退期。為了確?；盍?，遺傳穩定性和表型穩定，必須使細胞保持在對數期。

Q：那如何確定細胞對數期?

A：根據上述細胞生長(cháng)曲線(xiàn)，為了確?；盍?，必須使細胞保持在對數期就傳代，所以一定不能等到細胞長(cháng)滿(mǎn)100%融合時(shí)才去消化傳代。一般細胞長(cháng)到 70% -80%左右即可傳代。

Q：一般細胞傳代都是1分2嗎?

A：要根據不同細胞生長(cháng)速度以及后續實(shí)驗安排而定，沒(méi)有固定的必須1分幾，常規1分2至1分5都可以。此時(shí)我們就要多觀(guān)察摸索最合適的傳代比例。

Q：消化很關(guān)鍵嗎?

A：不得不說(shuō)，細胞狀態(tài)差，很多時(shí)候與傳代時(shí)胰酶消化密切相關(guān)。一般腫瘤細胞消化1-2min即可。但是每一種細胞貼壁能力不同，因此對胰酶的反應也不同，我們需要密切跟蹤。一般肉眼觀(guān)察到貼壁細胞層能移動(dòng)即可終止;而非細胞全部分散成單個(gè)。

Q：部分比較難消化的細胞怎么辦?

A：可放于37℃培養箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受細胞為例，放于37℃培養箱消化5-8min，輕輕拍打，才見(jiàn)細胞成片移動(dòng)，因此針對難消化細胞一定要在顯微鏡下密切觀(guān)察。

Q：幾天換培養基?

A：正常情況下，培養液偏紅色。如果細胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養基變黃，說(shuō)明培養液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細胞會(huì )脫落死亡，需要更換新鮮培養液。一般細胞生長(cháng)旺盛時(shí)1～2天換一次，生長(cháng)緩慢時(shí)，3～4天亦可。針對復蘇后的細胞，建議隔天換液。

Q：每天觀(guān)察細胞有必要嗎?

A：一般的腫瘤細胞我們是隔天傳代，但是切不可忽略對細胞的觀(guān)察，一定要每天都要去看一下細胞，肉眼觀(guān)察培養基狀況、顯微鏡下觀(guān)察細胞生長(cháng)狀況。記住，是每天。

Q：如果細胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理?

A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養基，用新的培養基或者PBS洗滌2-3次，再開(kāi)始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來(lái)的細胞懸液加入到新的培養瓶?jì)?。后續再密切觀(guān)察。

Q：細胞污染怎么辦?

A：如發(fā)現細胞有污染，一般建議丟棄。如果細胞非常寶貴，可試著(zhù)加入含抗生素的培養基反復清洗，并用抗生素含量高的培養基培養，并經(jīng)常更換培養基;

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